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Jun 01, 2023

In-vitro- und In-vivo-Studien an Pflanzen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14146 (2023) Diesen Artikel zitieren Metrikdetails Immun-Checkpoint-Inhibitoren sind eine bekannte Klasse von Immuntherapeutika, die für verwendet werden

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14146 (2023) Diesen Artikel zitieren

Details zu den Metriken

Immun-Checkpoint-Inhibitoren sind eine bekannte Klasse von Immuntherapeutika, die zur wirksamen Behandlung mehrerer Krebsarten eingesetzt werden. Atezolizumab (Tecentriq) war der erste Antikörper, der auf den Immuncheckpoint PD-L1 abzielte, und gehört heute zu den am häufigsten eingesetzten Krebstherapien. Allerdings wird dieser Anti-PD-L1-Antikörper in Säugetierzellen mit hohen Herstellungskosten produziert, was den Zugang von Krebspatienten zur Antikörperbehandlung einschränkt. Pflanzenexpressionssysteme sind eine weitere Plattform, die genutzt werden kann, da sie komplexe Glykoproteine ​​synthetisieren können, schnell skalierbar und relativ kosteneffizient sind. Dabei wurde Atezolizumab vorübergehend in Nicotiana benthamiana produziert und zeigte innerhalb von 4–6 Tagen nach der Infiltration ein hohes Expressionsniveau. Nach der Reinigung mittels Affinitätschromatographie wurde das gereinigte pflanzliche Atezolizumab mit Tecentriq verglichen und zeigte keine Glykosylierung. Darüber hinaus konnte das pflanzlich hergestellte Atezolizumab im ELISA mit vergleichbarer Affinität wie Tecentriq an PD-L1 binden. Es wurde auch festgestellt, dass die das Tumorwachstum hemmende Wirkung von pflanzlichem Atezolizumab bei Mäusen der von Tecentriq ähnelt. Diese Ergebnisse bestätigen die Fähigkeit der Anlage, als effiziente Produktionsplattform für immuntherapeutische Antikörper zu dienen, und legen nahe, dass sie dazu genutzt werden könnte, die Kosten bestehender Antikrebsprodukte zu senken.

Krebs ist eine Krankheit, die entsteht, wenn Tumorzellen unkontrolliert wachsen und sich auf andere Körperteile ausbreiten. Seitdem ist es zu einer der häufigsten Todesursachen beim Menschen geworden, mit den größten Auswirkungen in Entwicklungsländern1,2. Krebs wird mit einer Vielzahl von Methoden behandelt, darunter Operation, Chemotherapie, Strahlentherapie und Immuntherapie3. Immuntherapeutische Behandlungen unterstützen das Immunsystem bei der Krebsbekämpfung. Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs), adoptive Zelltransfertherapie und Krebsimpfstoffe gehören zu den wichtigsten Immuntherapien zur Behandlung von Krebs4.

ICIs sind monoklonale Antikörper (mAbs), die auf die inhibitorischen Immun-Checkpoints wie PD-1, PD-L1 und CTLA-45,6,7 abzielen und diese blockieren. Die Bindung von PD-1 an T-Zellen und PD-L1 an Krebszellen beispielsweise hemmt die Abtötung von Krebszellen durch T-Zellen. Wenn die PD-1/PD-L1-Bindung mit einem ICI blockiert wird, können T-Zellen Krebszellen abtöten und dabei körpereigene Immunzellen nutzen, um Tumorzellen anzugreifen4. ICIs allein oder in Kombination mit anderen Krebsbehandlungsoptionen haben als Standardbehandlung bei mehreren Krebsindikationen erhebliche Erfolge erzielt8,9,10,11. Bisher hat die FDA sieben kommerzielle ICIs12 zugelassen. Aufgrund der steigenden Kosten dieser Krebsbehandlungen haben Patienten jedoch nur begrenzten Zugang zu ihnen13,14.

Rekombinante Proteine ​​für den menschlichen Gebrauch sind aufgrund der hohen Herstellungskosten unerschwinglich teuer. Im Vergleich zu anderen Produktionsplattformen bietet die Pflanzenplattform viele Vorteile, darunter eine schnellere Produktion bei vorübergehender Expression15, Skalierbarkeit16, niedrigere vorgelagerte Produktionskosten als bei Säugetierzellen17,18 und ein geringeres Risiko einer Kontamination mit menschlichen Krankheitserregern19. Pflanzen sind auch zu posttranslationalen Modifikationen fähig, die für komplexe Proteine ​​wie mAbs20 erforderlich sind. Frühere Untersuchungen haben die Fähigkeiten der Pflanzenplattform bei der Herstellung rekombinanter mAbs gegen Ebola21, Tollwut22 und onkologische Anwendungen23,24,25 gezeigt.

In dieser Studie wurde die Pflanzenplattform zur Produktion von Anti-PD-L1-mAb und zur Bestimmung seiner Aktivität verwendet. Das gereinigte pflanzenproduzierte Atezolizumab wurde mittels SDS-PAGE und Western Blot charakterisiert und seine Aktivität mit dem kommerziellen Anti-PD-L1-mAb (Tecentriq) verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass das pflanzliche Atezolizumab etwas größer war als Tecentriq. In Bezug auf die Funktionsanalyse zeigte das pflanzenproduzierte Atezolizumab ähnliche Ergebnisse bei der Bindung an huPD-L1 in vitro und der Reduzierung von Tumorgewicht und -volumen bei Mäusen in vivo. Unsere Daten bestätigen, dass das Pflanzensystem biologisch aktive Proteine ​​mit ähnlichen Funktionen wie andere etablierte Plattformen produzieren kann. Noch wichtiger ist, dass diese Plattform das Potenzial hat, die damit verbundenen Kosten im vorgelagerten Prozess der Arzneimittelproduktion zu senken und dadurch den Patientenzugang zu biologischen Behandlungen zu verbessern.

Um eine Nicht-Glykan-Version von Atezolizumab zu erzeugen, wurden drei Aminosäuren (N298A, D359E und L361M) der schweren Kette mittels Überlappungs-PCR mutiert. Das Gen wurde in einen geminiviralen Vektor eingefügt und in A. tumefaciens transformiert. Die transformierten Bakterienzellen, die die schwere oder leichte Anti-PD-L1-Nicht-Glykan-Kette enthielten, wurden in die Blätter von N. Benthamiana koinfiltriert. Der Grad der Proteinexpression wurde mittels Tagesoptimierung bestimmt. Dementsprechend wurden die infiltrierten Blätter an verschiedenen Tagen nach der Infiltration (1, 3, 4, 5, 6 und 7 dpi) geerntet und die Expressionsniveaus von Atezolizumab durch quantitatives Sandwich-ELISA gemessen. Das Vorhandensein von Symptomen im infiltrierten Blattbereich bestätigt die Expression von mAb. Als jedoch in den späteren Tagen eine Nekrose auftrat, nahm die Atezolizumab-Expression ab. Das höchste Expressionsniveau von pflanzenproduziertem Atezolizumab ergab etwa 1,8 mg/g Frischgewicht innerhalb von 5 dpi (Abb. 1). SDS-PAGE und Western Blot wurden verwendet, um infiltrierten Rohextrakt mit nicht infiltriertem Rohextrakt zu vergleichen (Ergänzende Abbildungen 1 und 2). Unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen wurden die Rohproteine ​​mit InstantBlue-Farbstoff angefärbt (ergänzende Abbildung 1a) und die Expression von Atezolizumab in infiltriertem N. Benthamiana-Extrakt ergab Banden bei 50 und 150 kDa unter Verwendung von Anti-Human-IgG (ergänzende Abbildung 1b). , Spur 2) und bei 25 bzw. 150 kDa unter Verwendung von Anti-Human-Kappa (ergänzende Abbildung 1c, Spur 2). Wie erwartet fehlten diese Banden im nicht infiltrierten N. benthamiana-Extrakt (Ergänzende Abbildungen 1b, c, Spur 1).

Tagesoptimierungsexperiment für pflanzenproduziertes Atezolizumab. Infiltrierte N. benthamiana-Blätter wurden an den Tagen 1, 3, 4, 5, 6 und 7 nach der Infiltration (dpi) geerntet. Das Antikörperexpressionsniveau bei verschiedenen dpi wurde durch Sandwich-ELISA berechnet. Es wurden repräsentative Bilder von Blattnekrose und eine Grafik bereitgestellt, die die relative Expression von pflanzenproduziertem Atezolizumab zeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von dreifachen Proben dargestellt.

Pflanzlich hergestelltes Atezolizumab wurde aus infiltriertem N. benthamiana-Rohextrakt durch Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Eigenschaften von gereinigtem, aus Pflanzen hergestelltem Atezolizumab wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot untersucht (Abb. 2 und ergänzende Abb. 3). Unter nicht reduzierenden Bedingungen wurde das pflanzenproduzierte Atezolizumab bei 150 kDa mit InstantBlue (Abb. 2a), Anti-Human-IgG (Abb. 2c) und Anti-Human-Kappa (Abb. 2e) nachgewiesen. Unter reduzierenden Bedingungen wurde das pflanzenproduzierte Atezolizumab bei 50 kDa der schweren Kette und 25 kDa der leichten Kette mit InstantBlue (Abb. 2b), Anti-Human-IgG (Abb. 2d) und Anti-Human-Kappa (Abb. 2f) beobachtet ). Andererseits war das pflanzlich hergestellte Atezolizumab etwas größer und wies Banden mit höherem Molekulargewicht auf als Tecentriq (Abb. 2, Spuren 1 und 2). Die Ergebnisse von Western Blots, die mit Anti-Human-IgG und Anti-Human-Kappa untersucht wurden, bestätigen die Koexpression von schweren und leichten Ketten, was zu einem vollständig zusammengesetzten mAb führt.

SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse von Anti-PD-L1-mAbs. Tecentriq und gereinigtes pflanzliches Atezolizumab wurden durch nichtreduzierende (a, c und e) und reduzierende SDS-PAGE (b, d, f) getrennt. Etwa 2 µg mAbs wurden in die SDS-PAGE geladen, und 300 ng mAbs wurden für die Western-Blot-Analyse geladen. Die Gele wurden entweder mit InstantBlue-Farbstoff angefärbt (a,b) oder auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und mit Anti-Human-IgG (Schwerketten-spezifisch) (c,d) und Anti-Human-Kappa (Leichtketten-spezifisch) (e, F). Spur M: Proteinleiter; Spur 1: Tecentriq; Spur 2: gereinigtes pflanzliches Atezolizumab.

Die N-Glykan-Zusammensetzung der pflanzenproduzierten schweren Kette von Atezolizumab wurde mithilfe einer Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie-Analyse (LC-ESI-MS) analysiert und mit Tecentriq verglichen. Drei Stellen in der mAb-Fc-Region wurden mutiert, um die N-Glykosylierung unseres pflanzenproduzierten mAb zu hemmen. Die Ergebnisse bestätigten, dass dem mutierten, pflanzenproduzierten Atezolizumab Glykanstrukturen fehlen und er dem gleichen Muster wie Tecentriq folgt (Abb. 3).

Glykosylierungsanalyse von Tecentriq und gereinigtem pflanzlichen Atezolizumab. Tecentriq und gereinigtes pflanzliches Atezolizumab wurden mit Trypsin verdaut und mit LC-ESI-MS analysiert.

Die spezifische Antigenerkennung von pflanzlichem Atezolizumab wurde bestimmt und mit der von Tecentriq und pflanzlichem Nivolumab23 durch funktionellen ELISA verglichen. Sowohl das pflanzenproduzierte Atezolizumab als auch Tecentriq zeigten eine spezifische und vergleichbare Bindung an das huPD-L1-Protein, wohingegen pflanzenproduziertes Nivolumab keine Antigenbindung zeigte (Abb. 4). Diese Daten bestätigten, dass aus Pflanzen hergestelltes Atezolizumab in vitro an huPD-L1 binden kann und dass Dreifachmutationen in der konstanten Region der schweren Kette keinen Einfluss auf die Bindungsfähigkeit des aus Pflanzen stammenden mAb hatten.

Bindungsaffinität von gereinigtem pflanzlichem Atezolizumab an huPD-L1-Protein bei 2 µg/ml. Tecentriq wurde als Positivkontrolle und pflanzliches Nivolumab als Negativkontrolle verwendet. Zunehmende Verdünnungsreihen von mAbs wurden auf huPD-L1-Bindung getestet, die durch Anti-Human-Kappa-HRP nachgewiesen wurde. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von dreifachen Proben dargestellt.

Um die tumorwachstumshemmende (TGI) Wirksamkeit von pflanzenproduziertem Atezolizumab zu beurteilen, wurden einem BALB/c-hPD-1/hPD-L1/hCTLA-4-Mausmodell subkutan Maus-Dickdarmtumor-CT26-Zellen transplantiert, die hPD-L1 exprimieren. Der pflanzenproduzierte Anti-PD-L1-mAb wurde den Mäusen zusammen mit Tecentriq als Positivkontrolle und PBS als Negativkontrolle gemäß dem in Abb. 5a festgelegten Schema verabreicht. Den Mäusen wurden alle drei Tage 6 Dosen jedes mAb-Arzneimittels mit 3 mg/kg verabreicht, und bis zum 23. Tag wurden Daten zum Tumorvolumen (TV) und zum Körpergewicht der Maus gesammelt. Wie in Abb. 5b gezeigt, hatten Mäuse in allen drei Behandlungsgruppen ähnliche Ergebnisse Körpergewichte, was auf eine gute Verträglichkeit gegenüber einer kontinuierlichen Behandlung hinweist. Am 21. Tag reduzierten das pflanzenproduzierte Atezolizumab (TGITV = 41,90 %) und Tecentriq (TGITV = 24,59 %) das Wachstum von CT26-hPD-L1-Tumoren bei Mäusen im Vergleich zur Negativkontrolle signifikant (Ergänzungstabellen 1 und 2) ( P<0,05). Darüber hinaus unterschied sich die Tumorvolumenreduktion nicht zwischen den mit Anti-PD-L1-mAb behandelten Gruppen (Abb. 5c) (P > 0,05). Am Ende der Studie wurden alle Mäuse getötet und die Tumore gesammelt und gewogen (Tumorgewicht; TW). Die Tumorgrößen in den mit pflanzlichem Atezolizumab behandelten Gruppen (TGITW = 29,03 %) waren signifikant kleiner als die in der PBS-Kontrollgruppe (P < 0,05), wie in Abb. 5d und Ergänzungstabelle 3 dargestellt. Am wichtigsten ist die Antitumorwirksamkeit Die Konzentration von pflanzenproduziertem Atezolizumab unterschied sich in diesem syngenen murinen Darmkrebsmodell nicht signifikant von der seines in Säugetierzellen produzierten mAb-Gegenstücks (P > 0,05).

Antitumorwirksamkeit von pflanzenproduziertem Atezolizumab bei CT26-hPD-L1-tragenden „knock-in“-Mäusen. Tecentriq wurde als Positivkontrolle und PBS als Negativkontrolle verwendet. Drei Gruppen wurden gebildet (n = 6 Mäuse/Gruppe) und mit Anti-PD-L1-mAbs (3 mg/kg ip) und PBS injiziert. Der Zeitplan für die Dosisverabreichung und Datenerfassung wurde in (a) dargestellt. Behandlungsbedingte Auswirkungen wurden auf das Körpergewicht (b), das Tumorvolumen (c) und das Tumorgewicht (d) nachgewiesen. Die Daten wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA analysiert und als Mittelwert ± SD dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) sind eine Form der Immuntherapie, die in der Krebsbehandlung zunehmend an Bedeutung gewinnt. Diese Krebsmedikamente haben einen starken und langfristigen klinischen Nutzen gezeigt, sind aber auch teuer14,26. Der lange Zeitrahmen für Forschung und Entwicklung, die finanziellen Verpflichtungen klinischer Studien und die Kosten des Produktionsprozesses sind nur einige der vielen Faktoren, die zu einer prohibitiven Preisgestaltung für biopharmazeutische Arzneimittel führen. Bisher war die Erschwinglichkeit der Krebsbehandlung und von Biologika immer ein großes Problem. Die Arzneimittelpreise sollten gesenkt werden, damit mehr Patienten, insbesondere in unterentwickelten Ländern, eine angemessene Gesundheitsversorgung und Krebsbehandlung erhalten können. Auf diese Weise können die Herstellungskosten von Arzneimitteln durch die Maximierung der Produktionstechnologien gesenkt werden. Pflanzen stellen eine vielversprechende Plattform für die Herstellung biopharmazeutischer Produkte zu relativ geringen Kosten dar17,27,28. Sie haben das Potenzial, schnell und in großen Mengen pflanzliche Therapeutika mit geringem Kontaminationsrisiko herzustellen19. Die Produktions- und Wirtschaftsvorteile von Pflanzen stärkten das Versprechen, eine kompetente Pharmafabrik zu werden. Pflanzenzellen, Gewebe oder ganze Pflanzen gehören zu den primären Systemen, die bei der Herstellung therapeutischer rekombinanter Proteine ​​für kommerzielle, industrielle oder pharmazeutische Anwendungen verwendet werden29. Um die Pflanzenplattform zu untersuchen, wurde kommerzielles Atezolizumab (Tecentriq), hergestellt in Säugetierzellen, eines von sieben kommerziellen ICIs, die von der FDA12 zugelassen wurden, als Kontrolle im Vergleich zu Atezolizumab verwendet, das in N. benthamiana hergestellt wurde.

In früheren Studien haben geminivirale Vektoren die Voraussetzungen für die vorübergehende Expression wirksamer rekombinanter Proteine ​​und mAbs aus Pflanzen geschaffen23,30,31. Bemühungen, die Proteinexpressionsniveaus in Pflanzen durch Nutzung von Targeting-Sequenzen zu verbessern, werden seit langem in Betracht gezogen. Das Retentionsmotiv des endoplasmatischen Retikulums (ER), SEKDEL (Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu), zeigte beispielsweise ein effizienteres Targeting, was zu einer verstärkten Akkumulation von Proteinen in Pflanzen führte32,33. Darüber hinaus hat die Verwendung von Zellsekretionssignalen wie murinen Signalpeptiden erhöhte Mengen pflanzenproduzierter mAbs gegen das Tollwutvirus gezeigt, wobei Tollwut-mAb-Konstrukte, die diese murinen Signalsequenz tragen, stärker exprimiert wurden als solche, die ein pflanzliches Signalpeptid tragen34. Wie unsere vorherige Studie gezeigt hat, wurde ein hohes Maß an glykosylierter Atezolizumab-Expression auch in N. benthamiana-Pflanzen gefunden, die die Gene der schweren und leichten Kette mit einem murinen Signalpeptid am N-Terminus und einer SEKDEL-Sequenz am C-Terminus enthalten24. In ähnlicher Weise haben wir diese Transgene in dieser Studie verwendet und Mutationen (N298A, D359E und L361M) in die schwere Kette eingeführt, um die normale Glykosylierung des mAb zu verändern. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das mutierte Atezolizumab erfolgreich in Pflanzen exprimiert wurde, wobei die höchsten Mengen bis zu 1,8 mg/g Frischgewicht in Rohextrakten innerhalb von 5 Tagen nach der Infiltration erreichten, was mit früheren Berichten übereinstimmt24. Im Allgemeinen erreichen geminivirale Vektoren eine vorübergehende Expression pflanzlicher biopharmazeutischer Proteine ​​innerhalb von 2–6 Tagen nach der Agroinfiltration, abhängig von der Überempfindlichkeitsreaktion der Pflanzenblätter25,35,36.

Der pflanzenproduzierte mAb wurde weiter gereinigt und auf physikalisch-chemische Eigenschaften und molekulare Strukturen analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Schwerketten- und Leichtkettenbanden unter reduzierender SDS-PAGE und Western Blot nahezu zu ihren erwarteten Molekulargewichten (50 und 25 kDa) wanderten. Ebenso ergaben nichtreduzierende SDS-PAGE- und Immunoblot-Analysen, dass das pflanzenproduzierte mutierte Atezolizumab vollständig und korrekt zusammengesetzt war (150 kDa). Allerdings waren die scheinbaren Molekulargewichte der schweren Kette, der leichten Kette und des zusammengesetzten pflanzensynthetisierten mAb im Vergleich zu Tecentriq etwas höher. Diese geringe Größenzunahme kann auf die Zugabe von SEKDEL37,38,39 und dem 19 Aminosäuren langen murinen Signalpeptid40 zurückgeführt werden. Eine andere mögliche Erklärung könnte in der erfolglosen Spaltung des Signalpeptids39 liegen, die wir nicht bestätigt haben. Die Asparagin (N)-verknüpfte Glykosylierung ist eine häufige posttranslationale Modifikation, die an mehreren biologischen Funktionen wie Proteinfaltung, Stabilität, biologischer Aktivität, Interaktion und anderen beteiligt ist 41,42. Die frühen Stadien der pflanzlichen N-Glykosylierung scheinen konserviert zu sein und ähneln denen von Säugetierzellen43, die normalerweise im ER44 auftreten. Die Verarbeitung von mAb-N-Glykanen ist zu einem entscheidenden Aspekt in der biologischen Herstellung geworden. Im Fall von kommerziellem Atezolizumab (Tecentriq) führt die Glykomodifikation durch Aminosäuresubstitution an Position 298 (Asparagin zu Alanin; N298A) der schweren Kette zu einem nicht glykosylierten mAb. Diese Entfernung von N-Glykanen verringert oder hebt die Bindungsaffinität des Anti-PD-L1-mAb für Fcγ-Rezeptoren auf45,46. Hier haben wir mithilfe unserer Pflanzenexpressionsplattform ein nicht-glykosyliertes Atezolizumab generiert, indem wir Glykan-deletierende Mutationen in seine Fc-Region eingebaut haben, und es mit Tecentriq verglichen. Die ortsspezifische Glykosylierung wurde mittels LC-ESI-MS analysiert und in unserem pflanzenproduzierten Atezolizumab wurden keine Glykanstrukturen identifiziert. Diese Ergebnisse bestätigen die erfolgreiche Entfernung von N-Glykanen nach Mutationen an der konservierten Glykosylierungsstelle und stimmen mit den Daten des nicht glykosylierten Referenz-mAb überein. Darüber hinaus fungieren das murine Signalpeptid und das SEKDEL-Motiv, fusioniert mit pflanzenproduzierten mAb, nur als Leit- und Zielsequenzen für die Proteinexpression. Es ist jedoch bekannt, dass die Aglycosylierung von mAbs zu einer Aggregation führt42, die wiederum Anti-Arzneimittel-Antikörper induzieren kann47. In jüngerer Zeit wurde in mehreren Studien versucht, glykosylierte Varianten von Atezolizumab herzustellen, in der Hoffnung, die Stabilität und Aktivität der Antikörper zu verbessern48,49. Darüber hinaus wurden zwei Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 359 (Glutaminsäure zu Asparaginsäure; D359E) und 361 (Leucin zu Methionin; L361M) eingeführt, um der Proteinsequenz von Tecentriq zu folgen. Diese allotypischen Reste in IgG1 wurden durch entsprechende Aminosäuren von IgG2 verändert, was zu einer verringerten mAb-Bindungsaffinität zu FcγR50 führte.

Das pflanzlich hergestellte Atezolizumab bindet im funktionellen ELISA spezifisch an das menschliche PD-L1-Protein. Es zeigte auch eine vergleichbare Bindung wie Tecentriq, wohingegen pflanzliches Nivolumab nicht wie vorhergesagt an das Ziel bindete. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fc-Modifikationen keinen Einfluss auf die Antigenbindungskapazität unseres pflanzenproduzierten mAb hatten, was mit früheren Studien übereinstimmt24,48. Insgesamt veranschaulichen die hier präsentierten Ergebnisse, dass in Pflanzen ein funktioneller, nicht glykosylierter Anti-PD-L1-mAb mit spezifischer Bindungsaktivität an PD-L1 produziert werden kann. Die Atezolizumab-Immuntherapie gilt als Erstbehandlungsoption für Patienten mit metastasiertem Lungenkrebs51 und einigen Patienten mit fortgeschrittenem Urothelkrebs 52. Sie wurde auch in Kombination zur Behandlung bestimmter Krebsarten eingesetzt, darunter Leber-, Brust- und Dickdarmkrebs53. 54,55. In dieser Studie haben wir die Wirksamkeit unseres pflanzenproduzierten Atezolizumab in einem syngenen Mausmodell bewertet, dem subkutan muriner CT26-hPD-L1-Tumoren transplantiert wurden. Bei einer Dosis von 3 mg/kg zeigten unsere Ergebnisse eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums durch die Behandlung mit pflanzlichen mAb. Bemerkenswert ist, dass das pflanzlich hergestellte Atezolizumab im Vergleich zu Tecentriq eine ähnliche Rückbildung der Tumorvolumina und -gewichte zeigte. Darüber hinaus unterschieden sich die Antitumorreaktionen in den mit Anti-PD-L1-mAb behandelten Gruppen deutlich von denen in der PBS-Kontrollgruppe. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass hohe Dosen von Atezolizumab (10 mg/kg) die Antitumoraktivität in vivo erhöhten48. Allerdings könnten in Zukunft Dosissteigerungsexperimente für unser pflanzliches Atezolizumab untersucht werden, um die hemmende Reaktion auf das Tumorwachstum zu optimieren. Andererseits zeigten tumortragende Mäuse in keiner der Behandlungsgruppen signifikante Veränderungen des Körpergewichts, was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit pflanzlichem Atezolizumab sicher und verträglich ist56.

Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein Anti-PD-L1-Atezolizumab in N. bethamiana-Pflanzen ohne Glykosylierung in seiner schweren Kette erzeugt. Das glykomodifizierte, pflanzenproduzierte Atezolizumab hatte das gleiche N-Glykanmuster wie das aglykosylierte kommerzielle Atezolizumab (Tecentriq). Darüber hinaus hatten sowohl der pflanzliche mAb als auch Tecentriq in vitro vergleichbare Antigenbindungsaffinitäten zu menschlichem PD-L1. Am wichtigsten ist, dass unser pflanzliches Atezolizumab bei der Hemmung des Tumorwachstums in vivo genauso wirksam ist wie Tecentriq. Diese Ergebnisse bestätigen die Machbarkeit von Pflanzenplattformen sowohl für die biopharmazeutische Produktion als auch für die Immuntherapie. Falls gewünscht, könnten Pflanzen als weiteres Produktionssystem der Wahl in Betracht gezogen werden, mit dem Ziel, die Kosten für biopharmazeutische Arzneimittel in Entwicklungsländern zu senken.

Die Studie durfte vom internen CU-IBC (Chulalongkorn University-Institutional Biosafety Committee) unter Einhaltung aller Biosicherheitsrichtlinien für moderne Biotechnologie durchgeführt werden. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien/Vorschriften/Gesetzen durchgeführt. Die in der vorliegenden Studie verwendeten Samen von N. benthamiana wurden freundlicherweise von Dr. Supaart Sirikantaramas, Fakultät für Naturwissenschaften, Chulalongkorn-Universität, gespendet.

Diese Studie (Tierprotokoll Nr. GPTAP20220128-4) wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von GemPharmatech Co., Ltd. (Nanjing, China) geprüft und genehmigt. Die Pflege und Verwendung von Tieren für Experimente erfolgte in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Die Studie folgt den Empfehlungen der ARRIVE-Leitlinien.

Die Gene für die schwere Kette (HC) und die leichte Kette (LC) von Atezolizumab, die ein N-terminales murines Signalpeptid und ein C-terminales SEKDEL-Peptid tragen, waren zuvor erhalten worden24. Kurz gesagt, die Gen-kodierenden Sequenzen für HC und LC wurden in silico mit N. benthamiana-Codons durch Invitrogen GeneArt Gene Synthesis (Thermo Scientifc, USA) optimiert. Die variablen Domänen von Atezolizumab HC und LC wurden kommerziell synthetisiert und separat mit den konstanten Domänen der Gamma- bzw. Kappa-Kette von menschlichem IgG1 fusioniert. Hier wurden durch überlappende PCR-Methoden (N298A, D359E und L361M) mehrere Nukleotidsubstitutionen in die kodierende Sequenz von HC eingebaut, um ein nicht glykosyliertes Atezolizumab (NGAte) mit den gewünschten Mutationen zu erzeugen. Die zur Einführung spezifischer Punktmutationen in Atezolizumab HC verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Das resultierende mutierte HC-Produkt wurde durch Sequenzierung bestätigt. Sowohl die Atezolizumab HC- als auch die LC-Konstrukte wurden mit den Restriktionsenzymen XbaI und SacI (BioLabs, Massachusetts, USA) verdaut und in den geminiviralen Vektor pBY2eK (bereitgestellt von Professor Hugh Mason30) subkloniert. Zur bakteriellen Transformation wurde der Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 verwendet.

Die A. tumefaciens-Zellen, die pBY2eK-NGAte-HC und pBY2eK-Ate-LC enthielten, wurden in Luria Bertani (LB)-Medien (HiMedia Laboratories, Mumbai, Indien) kultiviert, ergänzt mit Kanamycin (50 mg/l), Gentamycin (50 mg/l). ) gekauft von AppliChem, Dermstadt, Deutschland, und Rifampicin (25 mg/L) gekauft von TOKU-E, Washington, USA. Die Bakterienkulturen wurden über Nacht bei 28 °C unter kontinuierlichem Schütteln (200 U/min) gezüchtet und in Infiltrationspuffer (10 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), pH 5,5, 10 mM MgSO4) auf eine OD600 von 0,2 verdünnt. Anschließend wurden die Bakterien im Verhältnis 1:1 gemischt und mittels Spritzeninfiltration (im kleinen Maßstab) oder Vakuuminfiltration (im großen Maßstab) in 6–8 Wochen alte N. benthamiana-Pflanzen co-agroinfiltriert. Die infiltrierten Pflanzen wurden in einem kontrollierten Pflanzenraum inkubiert und an den Tagen 1, 3, 4, 5, 6 und 7 nach der Agroinfiltration geerntet, um zeitabhängige mAb-Expressionsniveaus zu untersuchen. Die Blätter wurden mit 1×PBS extrahiert und dann 15 Minuten bei 24.000×g zentrifugiert. Die mAb-Konzentrationen in Rohproben wurden durch Untersuchung des Überstands im Sandwich-ELISA quantifiziert. Für die hier durchgeführten Reinigungsexperimente wurden infiltrierte Pflanzen zum optimalen Erntezeitpunkt der höchsten mAb-Produktion gesammelt und homogenisiert. Das pflanzenproduzierte Atezolizumab wurde durch Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigt, wie zuvor beschrieben 23.

SDS-PAGE- und Western-Blot-Assays wurden durchgeführt, um die Größe und Zusammensetzung des aus Pflanzen hergestellten Anti-PD-L1-mAb zu bestätigen. Proteinproben, darunter nicht infiltrierter Rohextrakt, agroinfiltrierter Rohextrakt, gereinigtes pflanzliches Atezolizumab und Tecentriq (Roche, Schweiz), wurden entweder mit nichtreduzierendem Beladungsfarbstoff (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 12 % (Gew./Vol.)) gemischt ) SDS, 10 % (v/v) Glycerin, 0,001 % (w/v) Bromphenolblau) oder reduzierender Ladefarbstoff (nicht reduzierender Ladefarbstoff mit 22 % (v/v) β-Mercaptoethanol). Die Proben wurden in 4–15 % Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit InstantBlue (Abcam, Cambridge, UK) sichtbar gemacht. Für die Western-Blot-Analyse wurden die Proteine ​​auf eine Nitrozellulosemembran (Bio-Rad, Massachusetts, USA) übertragen. Die Membran wurde mit 5 % (Gew./Vol.) Magermilch in 1 × PBS blockiert. Es wurden Ziegen-Anti-Human-Kappa-HRP (SouthernBiotech, Alabama, USA) im Verhältnis 1:5.000 und Ziegen-Anti-Human-IgG-HRP (SouthernBiotech, Alabama, USA) im Verhältnis 1:10.000 in 3 % (w/v) Magermilch verwendet Nachweisantikörper. Blots wurden unter Verwendung von ECL-Substrat (Promega, Wisconsin, USA) entwickelt und einem Röntgenfilm (Carestream, New York, USA) ausgesetzt.

Die Konzentration von mAb in rohen und gereinigten Proben wurde durch quantitatives Sandwich-ELISA berechnet. Eine halbflächige Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Corning, New York, USA) wurde über Nacht mit Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc (Abcam, Cambridge, UK) in einer Verdünnung von 1:1.000 in 1 × PBS beschichtet. Das Plattenwaschen erfolgte mit 1×PBS-T (1×PBS mit 0,05 % Tween 20) und das Blockieren erfolgte mit 5 % (w/v) Magermilch in 1×PBS. Serienverdünnte Pflanzenproben und der Standard für humane IgG1-Kappa-Isotyp-Antikörper (Abcam, Cambridge, UK) wurden auf den beschichteten Platten 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von der Detektion mit Ziegen-Anti-Human-Kappa-HRP (SouthernBiotech, Alabama, USA). bei 1:3.000 in 1×PBS. Schließlich wurde eine TMB-Substratlösung (Promega, Wisconsin, USA) zugegeben und die Reaktion mit 1 M H2SO4 gequencht. Die Absorption wurde bei 450 nm auf einem NS-100 Nano Scan-Mikroplattenlesegerät (Hercuvan, Shah Alam, Malaysia) gemessen.

Pflanzlich hergestelltes Atezolizumab und Tecentriq wurden in der reduzierenden SDS-PAGE getrennt. Die Bande der schweren Kette wurde herausgeschnitten, S-alkyliert und mit Trypsin verdaut. Das verdaute Peptid wurde dann wie zuvor beschrieben57 mittels Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS) analysiert.

Die Bindungsfähigkeit von pflanzlichem Atezolizumab an menschliches PD-L1 wurde in einem funktionellen Antigenbindungs-ELISA untersucht. Eine halbflächige Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Corning, New York, USA) wurde über Nacht mit rekombinantem huPD-L1-Protein (R&D System, Minneapolis, USA) in einer Konzentration von 2 µg/ml in 1 × PBS beschichtet. Dann wurde die Platte mit 1×PBS-T gewaschen und mit 5 % (w/v) Magermilch in 1×PBS blockiert. Pflanzlich hergestelltes Atezolizumab, Tecentriq-Standard und pflanzlich hergestellte Nivolumab-Kontrolle23 wurden seriell verdünnt und auf der beschichteten Platte 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Der Nachweis erfolgte mit Ziegen-Anti-Human-Kappa-HRP (SouthernBiotech, Alabama, USA) im Verhältnis 1:3.000 in 1 × PBS und die Peroxidaseaktivität wurde mit TMB einer Substratlösung (Promega, Wisconsin, USA) bestimmt. Die Farbentwicklung wurde überwacht und mit 1M H2SO4 gestoppt. Die Absorption wurde bei 450 nm auf einem NS-100 Nano Scan-Mikroplattenlesegerät (Hercuvan, Shah Alam, Malaysia) gemessen.

Knocked-in-weibliche Mäuse (Stamm BALB/c-hPD-1/hPD-L1/hCTLA-4) wurden von GemPharmatech Co., Ltd mit einer Versuchstierlizenz (SYXK (SU) 2018-0027) und experimentell bereitgestellt und entwickelt Tierproduktionslizenz (SCXK (SU) 2018-0008). Kurz gesagt, die kodierenden Sequenzen der extrazellulären Regionen von PD-1, PDL-1 und CTLA-4 wurden durch CRISPR/Cas9-Technologie auf BALB/c-Hintergrund durch menschliche Gegenstücke ersetzt (Ergänzende Abbildungen 4–6). In diesem Stamm kann die Expression von hPD-1, hPDL-1 und hCTLA-4 nachgewiesen werden (Ergänzende Abbildung 7). Darüber hinaus wurde kein offensichtlicher Unterschied im T/B/NK-Zellanteil zwischen Wildtyp- und humanisierten Mäusen beobachtet (ergänzende Abbildung 8). Somit kann dieser Stamm zur Bewertung von Antitumormitteln verwendet werden.

Die murine Darmkrebszelllinie CT26 wurde von ATCC (Virginia, USA) bezogen. Die CT26-hPDL-1-Zelllinie wurde entwickelt, indem das Maus-PD-L1-Gen mithilfe der CRISPR/Cas9-Technologie ausgeschaltet und ein konstitutiv exprimiertes menschliches PD-L1-Gen eingefügt wurde. Die Zellen wurden in Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640, Gibco, NY, USA) gezüchtet, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (ExCell Bio, Shanghai, China), 0,1 % Penicillin/Streptomycin (Amresco, Ohio, USA). ) Antibiotika und 200 μg/ml G418 (Gibco, New York, USA). Die mykoplasmenfreien Zellen wurden aufgetaut und bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Anschließend wurden CT26-hPDL-1-Zellen (Passage: Pn+12) gesammelt und in Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS; Gibco, NY, USA) resuspendiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde vor und nach der Inokulation berechnet und betrug 97,14 % bzw. 95,17 %. In dieser Studie wurden jeder humanisierten Maus im Alter von 6–8 Wochen 1.106 CT26-hPD-L1-Zellen subkutan in die rechte Flanke injiziert. Alle Mäuse (n=18) wurden zufällig in Gruppen (n=6 Mäuse/Gruppe) aufgeteilt, als der Tumor einen Durchmesser von 100 mm3 erreichte. Die Behandlungsgruppen erhielten entweder pflanzliches Atezolizumab (3 mg/kg) oder Tecentriq (3 mg/kg). Die Behandlung besteht aus intraperitonealen (ip) Antikörpermedikamenten alle 3 Tage für bis zu 6 Dosen (Q3D×6). Mäusen aus der Vehikelgruppe wurde 1×PBS injiziert. Die Wirkung der Behandlung wurde durch zweimal wöchentliche Überwachung des Tumorvolumens und des Körpergewichts der Maus bestimmt. Alle Mäuse wurden am 23. Tag getötet. Zu diesem Zeitpunkt wurden Tumore zur weiteren Analyse gesammelt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) ausgedrückt und mithilfe eines einfaktoriellen ANOVA-Tests analysiert.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind als ergänzende Informationen in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Diese Forschung wurde vom National Research Council of Thailand und Baiya Phytopharm Co., Ltd. unterstützt. Der Geldgeber war nicht am Studiendesign, der Sammlung, Analyse, Interpretation von Daten, dem Verfassen dieses Artikels oder der Entscheidung, ihn zur Veröffentlichung einzureichen, beteiligt . Diese Studie wird außerdem durch die BOKU Core Facility Mass Spectroscopy unterstützt.

Baiya Phytopharm Co., Ltd., Bangkok, Thailand

Kaewta Rattanapisit

Kompetenzzentrum für pflanzenproduzierte Arzneimittel, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, 10330, Thailand

Christine Joy I. Bulaon & Krieger Phoolcharoen

Abteilung für Pharmakognosie und Pharmazeutische Botanik, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, 10330, Thailand

Christine Joy I. Bulaon & Krieger Phoolcharoen

Abteilung für Angewandte Genetik und Zellbiologie, Universität für Bodenkultur, Muthgasse 18, 1190, Wien, Österreich

Richard Strasser

GemPharmatech Co., Ltd, Nanjing, China

Hongyan Sun

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WP konzipierte die Experimente, KR und CJIB führten Genklonierung, SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse, Antikörperquantifizierung und Bindungstest an PD-L1 durch, RS führte ein N-Glykan-Experiment durch, HS führte eine Antitumor-Wirksamkeitsstudie durch. Alle Autoren analysierten die Ergebnisse und überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Waranyoo Phoolcharoen.

WP von der Chulalongkorn-Universität ist Gründer/Aktionär von Baiya Phytopharm Co., Ltd. Thailand. KR ist Angestellter bei Baiya Phytopharm Co., Ltd. HS ist Angestellter bei GemPharmatech Co., Ltd. Die übrigen Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Es sind keine relevanten nichtfinanziellen Interessen anzugeben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rattanapisit, K., Bulaon, CJI, Strasser, R. et al. In-vitro- und In-vivo-Studien zu pflanzlichem Atezolizumab als potenziellem immuntherapeutischen Antikörper. Sci Rep 13, 14146 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41510-w

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Eingegangen: 01. April 2023

Angenommen: 28. August 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41510-w

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